2 × Pfu PCR മിക്സ്

A-1 ടെംപ്ലേറ്റ്

ടെംപ്ലേറ്റിൽ പ്രോട്ടീൻ മാലിന്യങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ ടാക് ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ മുതലായവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു - ഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റ് ശുദ്ധീകരിക്കുക, പ്രോട്ടീൻ മാലിന്യങ്ങൾ നീക്കം ചെയ്യുക അല്ലെങ്കിൽ ടെംപ്ലേറ്റ് ഡിഎൻഎ എക്സ്ട്രാക്റ്റ് ചെയ്യുക.

Temp ടെംപ്ലേറ്റ് ഡീനാറ്ററേഷൻ പൂർത്തിയായിട്ടില്ല —— ഉചിതമായി ഡിനാറ്ററേഷൻ താപനില വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ഡീനാറ്ററേഷൻ സമയം ദീർഘിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.

Mp ടെംപ്ലേറ്റ് ഡീഗ്രഡേഷൻ —— ടെംപ്ലേറ്റ് വീണ്ടും തയ്യാറാക്കുക.

എ -2 പ്രൈമർ

Pri പ്രൈമറുകളുടെ മോശം നിലവാരം —— പ്രൈമർ വീണ്ടും സമന്വയിപ്പിക്കുക.

Mer പ്രൈമർ ഡീഗ്രഡേഷൻ —— സംരക്ഷണത്തിനായി ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയുള്ള പ്രൈമറുകൾ ചെറിയ അളവിലേക്ക് മാറ്റുക. ഒന്നിലധികം മരവിപ്പിക്കൽ, ഉരുകൽ അല്ലെങ്കിൽ ദീർഘകാല 4 ° C ക്രയോപ്രെസർവ്ഡ് എന്നിവ ഒഴിവാക്കുക.

Pri പ്രൈമറുകളുടെ തെറ്റായ ഡിസൈൻ (ഉദാ: പ്രൈമർ ദൈർഘ്യം പോരാ

A-3 Mg²⁺ഏകാഗ്രത

G എംജി²⁺ ഏകാഗ്രത വളരെ കുറവാണ് —— Mg കൃത്യമായി വർദ്ധിപ്പിക്കുക²⁺ ഏകാഗ്രത: Mg ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുക²⁺ ഒപ്റ്റിമൽ Mg നിർണ്ണയിക്കാൻ 0.5 mM ഇടവേളയിൽ 1 mM മുതൽ 3 mM വരെയുള്ള പ്രതികരണങ്ങളുടെ ഒരു പരമ്പരയിലൂടെ ഏകാഗ്രത²⁺ ഓരോ ടെംപ്ലേറ്റിനും പ്രൈമറിനുമുള്ള ഏകാഗ്രത.

A-4 അനിയലിംഗ് താപനില

An ഉയർന്ന അനിയലിംഗ് താപനില പ്രൈമറിന്റെയും ടെംപ്ലേറ്റിന്റെയും ബൈൻഡിംഗിനെ ബാധിക്കുന്നു. —— അനിയലിംഗ് താപനില കുറയ്ക്കുകയും 2 ° C ഗ്രേഡിയന്റ് ഉപയോഗിച്ച് അവസ്ഥ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുക.

A-5 വിപുലീകരണ സമയം

Extension ഹ്രസ്വ വിപുലീകരണ സമയം —— വിപുലീകരണ സമയം വർദ്ധിപ്പിക്കുക.

പ്രതിഭാസം: നെഗറ്റീവ് സാമ്പിളുകളും ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് ബാൻഡുകൾ കാണിക്കുന്നു.

പിസിആറിന്റെ എ -1 മലിനീകരണം

Target ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് അല്ലെങ്കിൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ക്രോസ് മലിനീകരണം —— നെഗറ്റീവ് സാമ്പിളിൽ ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് അടങ്ങിയ സാമ്പിൾ പൈപ്പ് ചെയ്യരുത് അല്ലെങ്കിൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിൽ നിന്ന് പുറത്തേക്ക് ഒഴിക്കരുത്. നിലവിലുള്ള ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകൾ ഇല്ലാതാക്കാൻ റിയാക്ടറുകളോ ഉപകരണങ്ങളോ ഓട്ടോക്ലേവ് ചെയ്യണം, കൂടാതെ നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണ പരീക്ഷണങ്ങളിലൂടെ മലിനീകരണത്തിന്റെ അസ്തിത്വം നിർണ്ണയിക്കണം.

Ag റിയാജന്റ് മലിനീകരണം —— റിയാക്ടറുകളോട് ചേർന്ന് കുറഞ്ഞ താപനിലയിൽ സൂക്ഷിക്കുക.

എ -2 പ്രൈംr

G എംജി²⁺ ഏകാഗ്രത വളരെ കുറവാണ് —— Mg കൃത്യമായി വർദ്ധിപ്പിക്കുക²⁺ ഏകാഗ്രത: Mg ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുക²⁺ ഒപ്റ്റിമൽ Mg നിർണ്ണയിക്കാൻ 0.5 mM ഇടവേളയിൽ 1 mM മുതൽ 3 mM വരെയുള്ള പ്രതികരണങ്ങളുടെ ഒരു പരമ്പരയിലൂടെ ഏകാഗ്രത²⁺ ഓരോ ടെംപ്ലേറ്റിനും പ്രൈമറിനുമുള്ള ഏകാഗ്രത.

Pri തെറ്റായ പ്രൈമർ ഡിസൈൻ, ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസിന് നോൺ-ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസുമായി ഹോമോളജി ഉണ്ട്. —— പ്രൈമറുകൾ വീണ്ടും രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുക.

പ്രതിഭാസം: പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബാൻഡുകൾ പ്രതീക്ഷിക്കുന്ന വലുപ്പവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നില്ല, വലുതോ ചെറുതോ അല്ലെങ്കിൽ ചിലപ്പോൾ നിർദ്ദിഷ്ട ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബാൻഡുകളും നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബാൻഡുകളും സംഭവിക്കുന്നു.

എ -1 പ്രൈമർ

Pri മോശം പ്രൈമർ പ്രത്യേകത

—— റീ-ഡിസൈൻ പ്രൈമർ.

Mer പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷൻ വളരെ കൂടുതലാണ് —— ഡിനാറ്ററേഷൻ താപനില കൃത്യമായി വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ഡിനാറ്ററേഷൻ സമയം ദീർഘിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.

A-2 Mg²⁺ ഏകാഗ്രത

എംജി²⁺ ഏകാഗ്രത വളരെ കൂടുതലാണ് —— Mg2+ ഏകാഗ്രത ശരിയായി കുറയ്ക്കുക: Mg ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുക²⁺ ഒപ്റ്റിമൽ Mg നിർണ്ണയിക്കാൻ 0.5 mM ഇടവേളയിൽ 1 mM മുതൽ 3 mM വരെയുള്ള പ്രതികരണങ്ങളുടെ ഒരു പരമ്പരയിലൂടെ ഏകാഗ്രത²⁺ ഓരോ ടെംപ്ലേറ്റിനും പ്രൈമറിനുമുള്ള ഏകാഗ്രത.

എ -3 തെർമോസ്റ്റബിൾ പോളിമറേസ്

En അമിതമായ എൻസൈം തുക —— 0.5 U ഇടവേളകളിൽ ഉചിതമായ എൻസൈം തുക കുറയ്ക്കുക.

A-4 അനിയലിംഗ് താപനില

Ne അനിയലിംഗ് താപനില വളരെ കുറവാണ് —— അനുചിതമായ താപനില വർദ്ധിപ്പിക്കുക അല്ലെങ്കിൽ രണ്ട്-ഘട്ട അനിയലിംഗ് രീതി സ്വീകരിക്കുക

A-5 PCR സൈക്കിളുകൾ

P വളരെയധികം PCR സൈക്കിളുകൾ —— PCR സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം കുറയ്ക്കുക.

എ -1 പ്രൈമർ———————————————————————————————————————————————————————————————————— അല്ലെങ്കിൽ കൂടുകൂട്ടിയ PCR നടത്തുക.

എ -2 ടെംപ്ലേറ്റ് ഡിഎൻഎ

ടെംപ്ലേറ്റ് ശുദ്ധമല്ല - ടെംപ്ലേറ്റ് ശുദ്ധീകരിക്കുക അല്ലെങ്കിൽ ഡിഎൻഎയെ ശുദ്ധീകരണ കിറ്റുകൾ ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുക്കുക.

A-3 Mg²⁺ ഏകാഗ്രത

——Mg²⁺ ഏകാഗ്രത വളരെ കൂടുതലാണ് —— Mg ശരിയായി കുറയ്ക്കുക²⁺ ഏകാഗ്രത: Mg ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുക²⁺ ഒപ്റ്റിമൽ Mg നിർണ്ണയിക്കാൻ 0.5 mM ഇടവേളയിൽ 1 mM മുതൽ 3 mM വരെയുള്ള പ്രതികരണങ്ങളുടെ ഒരു പരമ്പരയിലൂടെ ഏകാഗ്രത²⁺ ഓരോ ടെംപ്ലേറ്റിനും പ്രൈമറിനുമുള്ള ഏകാഗ്രത.

A-4 dNTP

——DNTP- യുടെ സാന്ദ്രത വളരെ കൂടുതലാണ് —— dNTP- യുടെ സാന്ദ്രത ഉചിതമായി കുറയ്ക്കുക

A-5 അനിയലിംഗ് താപനില

—— വളരെ കുറഞ്ഞ അളവിലുള്ള താപനില —— അനുബന്ധ താപനില ഉചിതമായി വർദ്ധിപ്പിക്കുക

എ -6 സൈക്കിളുകൾ

—— വളരെയധികം സൈക്കിളുകൾ —— സൈക്കിൾ നമ്പർ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുക

ഉചിതമായ പോളിമറേസ് തിരഞ്ഞെടുക്കുക എന്നതാണ് ആദ്യപടി. 3'-5 'എക്സോ ന്യൂക്ലീസ് പ്രവർത്തനത്തിന്റെ അഭാവം മൂലം റെഗുലർ ടാക് പോളിമറേസിന് പ്രൂഫ് റീഡ് ചെയ്യാൻ കഴിയില്ല, കൂടാതെ പൊരുത്തക്കേട് ശകലങ്ങളുടെ വിപുലീകരണ കാര്യക്ഷമതയെ ഗണ്യമായി കുറയ്ക്കും. അതിനാൽ, സാധാരണ ടാക് പോളിമറേസിന് 5 കെബിയിൽ കൂടുതലുള്ള ടാർഗെറ്റ് ശകലങ്ങൾ ഫലപ്രദമായി വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയില്ല. വിപുലീകരണ കാര്യക്ഷമത മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനും നീണ്ട ശകലങ്ങൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനും പ്രത്യേക പരിഷ്ക്കരണങ്ങളോ മറ്റ് ഉയർന്ന വിശ്വാസ്യതയുള്ള പോളിമറേസുകളോ ഉള്ള ടാക് പോളിമറേസ് തിരഞ്ഞെടുക്കണം. കൂടാതെ, നീളമുള്ള ശകലങ്ങൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് പ്രൈമർ ഡിസൈൻ, ഡീനാറ്ററേഷൻ സമയം, എക്സ്റ്റൻഷൻ സമയം, ബഫർ പിഎച്ച്, മുതലായവ ക്രമീകരിക്കേണ്ടതുണ്ട്. ടെംപ്ലേറ്റ് കേടുപാടുകൾ തടയുന്നതിന്, 94 ° C ലെ ഡീനാറ്ററേഷൻ സമയം ഓരോ ചക്രത്തിലും 30 സെക്കന്റോ അതിൽ കുറവോ ആയി കുറയ്ക്കണം, ആംപ്ലിഫിക്കേഷന് മുമ്പ് താപനില 94 ° C ആയി ഉയർത്താനുള്ള സമയം 1 മിനിറ്റിൽ കുറവായിരിക്കണം. കൂടാതെ, വിപുലീകരണ താപനില ഏകദേശം 68 ° C ആയി ക്രമീകരിക്കുകയും 1 kb/min എന്ന നിരക്കനുസരിച്ച് വിപുലീകരണ സമയം രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുകയും ചെയ്താൽ നീണ്ട ശകലങ്ങളുടെ ഫലപ്രദമായ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉറപ്പാക്കാനാകും.

ഉയർന്ന വിശ്വാസ്യതയുള്ള വിവിധ ഡിഎൻഎ പോളിമറേസുകൾ ഉപയോഗിച്ച് പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ പിശക് നിരക്ക് കുറയ്ക്കാൻ കഴിയും. ഇതുവരെ കണ്ടെത്തിയിട്ടുള്ള എല്ലാ Taq DNA പോളിമറേസുകളിലും Pfu എൻസൈമിന് ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ പിശക് നിരക്കും ഏറ്റവും ഉയർന്ന വിശ്വസ്തതയും ഉണ്ട് (അറ്റാച്ചുചെയ്ത പട്ടിക കാണുക). എൻസൈം തിരഞ്ഞെടുപ്പിന് പുറമേ, ബഫർ കോമ്പോസിഷൻ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുക, തെർമോസ്റ്റബിൾ പോളിമറേസ് ഏകാഗ്രത, പിസിആർ സൈക്കിൾ നമ്പർ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുക എന്നിവയുൾപ്പെടെയുള്ള പ്രതികരണ സാഹചര്യങ്ങൾ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുന്നതിലൂടെ ഗവേഷകർക്ക് പിസിആർ മ്യൂട്ടേഷൻ നിരക്ക് കുറയ്ക്കാനാകും.