ഫാസ്റ്റ്കിംഗ് ജിഡിഎൻഎ ഡിസ്പെല്ലിംഗ് ആർടി സൂപ്പർമിക്സ്

A-1 RNA അധdedപതിച്ചിരിക്കുന്നു

—— മലിനീകരണമില്ലാതെ ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള ആർഎൻഎ ശുദ്ധീകരിക്കുക. ആർ‌എൻ‌എ വേർതിരിച്ചെടുത്ത മെറ്റീരിയൽ ആർ‌എൻ‌എ അപചയം തടയാൻ കഴിയുന്നത്ര പുതുതായിരിക്കണം. ആർടി പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന് മുമ്പ് ഡിഎൻഎച്ചേറ്റഡ് ജെല്ലിൽ ആർഎൻഎ സമഗ്രത വിശകലനം ചെയ്യുക. ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുത്ത ശേഷം, അത് 100% ഫോർമാമൈഡിൽ സൂക്ഷിക്കണം. RNase ഇൻഹിബിറ്റർ ഉപയോഗിക്കുന്നുവെങ്കിൽ, ചൂടാക്കൽ താപനില <45 ° C ആയിരിക്കണം, കൂടാതെ pH 8.0 ൽ കുറവായിരിക്കണം, അല്ലാത്തപക്ഷം ഇൻഹിബിറ്റർ എല്ലാ ബന്ധിത RNase- കളെയും പുറത്തുവിടും. കൂടാതെ, RNase ഇൻഹിബിറ്റർ ≥ 0.8 mM DTT അടങ്ങിയ പരിഹാരങ്ങളിൽ ചേർക്കണം.

A-2 RNA- ൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രതികരണങ്ങളുടെ ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു

റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഇൻഹിബിറ്ററുകളിൽ SDS, EDTA, ഗ്ലിസറോൾ, സോഡിയം പൈറോഫോസ്ഫേറ്റ്, സ്പെർമിഡിൻ, ഫോർമാമൈഡ്, ഗ്വാണിഡൈൻ ഉപ്പ്, തുടങ്ങിയവ ഉൾപ്പെടുന്നു. ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ നീക്കംചെയ്യാൻ 70% (v/v) എത്തനോൾ ഉപയോഗിച്ച് RNA മഴ കഴുകുക.

സിഡിഎൻഎയുടെ ആദ്യ സ്ട്രാന്റ് സമന്വയിപ്പിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന പ്രൈമറുകളുടെ എ -3 അപര്യാപ്തമായ അനിയലിംഗ്

—— പരീക്ഷണത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന പ്രൈമറുകൾക്ക് അനിയലിംഗ് താപനില അനുയോജ്യമാണെന്ന് നിർണ്ണയിക്കുക. ക്രമരഹിതമായ ഹെക്സാമറുകൾക്ക്, പ്രതികരണ താപനിലയിൽ എത്തുന്നതിനുമുമ്പ് 10 മിനിറ്റ് 25 ° C താപനില നിലനിർത്താൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു. ജീൻ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾക്ക് (ജിഎസ്പി), മറ്റ് ജിഎസ്പി പരീക്ഷിക്കുക, അല്ലെങ്കിൽ ഒളിഗോ (ഡിടി) അല്ലെങ്കിൽ റാൻഡം ഹെക്സാമറിലേക്ക് മാറുക.

A-4 ആരംഭിക്കുന്ന RNA യുടെ ചെറിയ തുക

—— RNA യുടെ അളവ് വർദ്ധിപ്പിക്കുക. 50 ng- ൽ കുറവുള്ള RNA സാമ്പിളുകൾക്ക്, 0.1 μg മുതൽ 0.5 μg അസറ്റൈൽ BSA ആദ്യ സ്ട്രാൻഡ് cDNA സിന്തസിസിൽ ഉപയോഗിക്കാം

എ -5 വിശകലനം ചെയ്ത ടിഷ്യൂകളിൽ ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് പ്രകടിപ്പിച്ചിട്ടില്ല.

—— മറ്റ് ടിഷ്യൂകൾ ശ്രമിക്കുക.

A-6 PCR പ്രതികരണം പരാജയപ്പെടുന്നു

—— രണ്ട് ഘട്ടങ്ങളുള്ള ആർടി-പിസിആറിന്, പിസിആർ ഘട്ടത്തിലെ സിഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റ് പ്രതികരണ വോളിയത്തിന്റെ 1/5 കവിയാൻ പാടില്ല.

A-1 പ്രൈമറുകളുടെയും ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെയും നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത അനിയലിംഗ്

പ്രൈമറുകളുടെ 3'-അറ്റത്ത് 2-3 dG അല്ലെങ്കിൽ dC അടങ്ങിയിരിക്കരുത്. റാൻഡം പ്രൈമറുകൾ അല്ലെങ്കിൽ ഒളിഗോ (ഡിടി) എന്നതിനുപകരം ആദ്യ സ്ട്രാൻഡ് സിന്തസിസിൽ ജീൻ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കുക. ആദ്യ ചക്രങ്ങളിൽ ഉയർന്ന അനിയലിംഗ് താപനില ഉപയോഗിക്കുക, തുടർന്ന് കുറഞ്ഞ അളവിലുള്ള താപനില. പ്രതികരണത്തിന്റെ പ്രത്യേകത മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിന് പിസിആറിനായി ഹോട്ട്-സ്റ്റാർട്ട് ടാക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് ഉപയോഗിക്കുക.

A-2 ജീൻ നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകളുടെ മോശം ഡിസൈൻ

—— ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രൈമർ ഡിസൈനിനുള്ള അതേ തത്വങ്ങൾ പിന്തുടരുക.

A-3 RNA ജീനോമിക് ഡി.എൻ.എ

—— PCR- ഗ്രേഡ് DNase I ഉപയോഗിച്ച് RNA ചികിത്സിക്കുക. DNA മലിനീകരണം കണ്ടെത്തുന്നതിന് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഇല്ലാതെ ഒരു നിയന്ത്രണ പ്രതികരണം സജ്ജമാക്കുക.

എ -4 പ്രൈമർ ഡൈമറിന്റെ രൂപീകരണം

—— 3 'അറ്റത്ത് കോംപ്ലിമെന്ററി സീക്വൻസുകൾ ഇല്ലാതെ പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുക.

A-5 വളരെ ഉയർന്ന Mg²⁺ ഏകാഗ്രത

—— Mg ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുക²⁺ ഓരോ ടെംപ്ലേറ്റിനും പ്രൈമർ കോമ്പിനേഷനുമുള്ള ഏകാഗ്രത

A-6 വിദേശ ഡി.എൻ.എ

——എയറോസോൾ പ്രതിരോധശേഷിയുള്ള നുറുങ്ങുകളും UDG എൻസൈമുകളും ഉപയോഗിക്കുക.

A-1 ആദ്യത്തെ സ്ട്രാൻഡ് ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ ഉള്ളടക്കം വളരെ ഉയർന്നതാണ്

—— പരമ്പരാഗത പിസിആർ പ്രതികരണ ഘട്ടത്തിലെ ആദ്യ സ്ട്രോണ്ട് ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ അളവ് കുറയ്ക്കുക.

PCR പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിൽ A-2 വളരെ ഉയർന്ന പ്രൈമർ തുക

—— പ്രൈമർ ഇൻപുട്ട് കുറയ്ക്കുക.

A-3 വളരെയധികം സൈക്കിളുകൾ

—— PCR പ്രതികരണ സാഹചര്യങ്ങൾ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുകയും PCR സൈക്കിൾ നമ്പർ കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്യുക.

A-4 വളരെ കുറഞ്ഞ അളവിലുള്ള താപനില

—— നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത തുടക്കവും വിപുലീകരണവും തടയുന്നതിന് അനിയലിംഗ് താപനില വർദ്ധിപ്പിക്കുക.

എ -5 ഡിഎൻഎയുടെ ഡിഎൻ‌എസ് ഡീഗ്രേഡേഷൻ സൃഷ്ടിക്കുന്ന ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് ശകലങ്ങളുടെ നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ-ഡിഎൻഎ മലിനീകരണം തടയാൻ ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള ആർഎൻഎ എക്സ്ട്രാക്റ്റ് ചെയ്യുക.

ആർടിഎ-പിസിആർ എന്നത് ആർഎൻഎയെ സിഡിഎൻഎയിലേക്ക് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് ചെയ്യുക, തുടർന്ന് ടാർഗെറ്റ് ശകലം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് പിസിആർ പ്രതികരണത്തിനുള്ള ടെംപ്ലേറ്റായി റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് ചെയ്ത സിഡിഎൻഎ ഉപയോഗിക്കുക. പരീക്ഷണത്തിന്റെ പ്രത്യേക വ്യവസ്ഥകൾക്കനുസൃതമായി ക്രമരഹിതമായ പ്രൈമറുകൾ, ഒലിഗോ ഡിടി, ജീൻ നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ എന്നിവ തിരഞ്ഞെടുക്കുക. ഹെയർപിൻ ഘടനയില്ലാത്ത ഹ്രസ്വ യൂക്കറിയോട്ടിക് സെൽ എംആർഎൻഎയ്ക്ക് മുകളിലുള്ള എല്ലാ പ്രൈമറുകളും ഉപയോഗിക്കാം.

റാൻഡം പ്രൈമർ: ഹെയർപിൻ ഘടനയുള്ള ദീർഘമായ ആർഎൻഎയ്ക്കും, ആർആർഎൻഎ, എംആർഎൻഎ, ടിആർഎൻഎ മുതലായ എല്ലാ ആർഎൻഎകൾക്കും അനുയോജ്യമാണ്, അവ പ്രധാനമായും ഒറ്റ ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ ആർടി-പിസിആർ പ്രതികരണത്തിന് ഉപയോഗിക്കുന്നു.

ഒലിഗോ ഡിടി: പോളിഎ ടെയ്‌ലിംഗുള്ള ആർ‌എൻ‌എയ്ക്ക് അനുയോജ്യമാണ് (പ്രോകാരിയോട്ടിക് ആർ‌എൻ‌എ, യൂക്കറിയോട്ടിക് ഒലിഗോ ഡിടി ആർ‌ആർ‌എൻ‌എ, ടി‌ആർ‌എൻ‌എ എന്നിവയ്ക്ക് പോളിഎ ടെയിലുകൾ ഇല്ല). ഒലിഗോ ഡിടി പോളിഎ ടെയിലുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നതിനാൽ, ആർ‌എൻ‌എ സാമ്പിളുകളുടെ ഗുണനിലവാരം ഉയർന്നതായിരിക്കണം, കൂടാതെ ഒരു ചെറിയ അളവിലുള്ള അപചയം പോലും പൂർണ്ണ-ദൈർഘ്യമുള്ള സിഡി‌എൻ‌എ സമന്വയത്തിന്റെ അളവ് വളരെയധികം കുറയ്ക്കും.

ജീൻ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമർ: ടെംപ്ലേറ്റ് സീക്വൻസിന് അനുബന്ധമാണ്, ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് അറിയപ്പെടുന്ന സാഹചര്യങ്ങൾക്ക് അനുയോജ്യമാണ്.

രണ്ട് വഴികളുണ്ട്:

1. ആന്തരിക റഫറൻസ് രീതി: സിദ്ധാന്തത്തിൽ, സിഡിഎൻഎ എന്നത് വ്യത്യസ്ത നീളത്തിലുള്ള ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളാണ്, അതിനാൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസിന്റെ ഫലം സ്മിയർ ആണ്. ആർ‌എൻ‌എ സമൃദ്ധി കുറവാണെങ്കിൽ, ഒരു ഉൽപ്പന്നവും ഇലക്ട്രോഫോറെസിസിൽ കാണിക്കില്ല, എന്നാൽ ഇതിനർത്ഥം പിസിആർ ഒരു ഉൽപ്പന്നവും വർദ്ധിപ്പിക്കില്ല എന്നാണ്. പൊതുവേ, സിഡിഎൻഎ കണ്ടുപിടിക്കാൻ ആന്തരിക റഫറൻസ് ഉപയോഗിക്കാം. ആന്തരിക റഫറൻസിന് ഫലങ്ങളുണ്ടെങ്കിൽ, സിഡിഎൻഎയുടെ ഗുണനിലവാരം അടിസ്ഥാനപരമായി ഉറപ്പുനൽകാൻ കഴിയും (ഏതാനും സന്ദർഭങ്ങളിൽ, ടാർഗെറ്റ് ചെയ്ത ജീൻ ശകലം ദൈർഘ്യമേറിയതാണെങ്കിൽ, ഒഴിവാക്കലുകൾ ഉണ്ടാകാം).

2. ഈ ടെംപ്ലേറ്റ് വികസിപ്പിച്ച ഒരു അറിയപ്പെടുന്ന ജീൻ ഉണ്ടെങ്കിൽ, ഈ ജീനിന്റെ പ്രൈമറുകൾക്ക് അത് പരിശോധിക്കാൻ കഴിയും. ആന്തരിക റഫറൻസിന്റെ വ്യാപ്തി സിഡിഎൻഎയിൽ ഒരു പ്രശ്നവുമില്ലെന്ന് അർത്ഥമാക്കുന്നില്ല. സിഡിഎൻഎയിൽ ആന്തരിക റഫറൻസിന് ഉയർന്ന സമൃദ്ധി ഉള്ളതിനാൽ, അത് വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ എളുപ്പമാണ്. വിവിധ കാരണങ്ങളാൽ സിഡിഎൻഎ ഭാഗികമായി തരംതാഴ്ത്തപ്പെടുകയാണെങ്കിൽ, സാധ്യതയുടെ വീക്ഷണകോണിൽ നിന്ന്, കുറഞ്ഞ സമൃദ്ധി ടാർഗെറ്റ് ജീനുകളുടെ പിസിആർ ഫലങ്ങൾ വളരെയധികം ബാധിക്കപ്പെടും. ആന്തരിക അവലംബം ഇപ്പോഴും സമൃദ്ധമായിരിക്കുമ്പോൾ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷനെ ബാധിക്കില്ല.

ആർ‌എൻ‌എയുടെ ഭാഗികമായി തരംതാഴ്ത്തൽ. ആർഎൻഎയുടെ സമഗ്രതയും ശുദ്ധീകരണവും കണ്ടെത്തുക

വ്യത്യസ്ത ജീവിവർഗങ്ങളുടെ ആർഎൻഎ ഉള്ളടക്കം വ്യത്യസ്തമായിരിക്കാം, പക്ഷേ പൊതുവേ, വേർതിരിച്ചെടുത്ത മൊത്തം ആർഎൻഎയിൽ ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസിൽ രണ്ട് വ്യക്തമായ 28 എസ്, 18 എസ് ബാൻഡുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കണം, കൂടാതെ മുൻ ബാൻഡിന്റെ തെളിച്ചം രണ്ടാമത്തേതിനേക്കാൾ ഇരട്ടിയായിരിക്കണം. 5 എസ് ബാൻഡ് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് ആർഎൻഎ അധdedപതിച്ചുവെന്നാണ്, അതിന്റെ തെളിച്ചം തരംതാഴ്ത്തലിന്റെ അളവിന് ആനുപാതികമാണ്. ആന്തരിക റഫറൻസിന്റെ വിജയകരമായ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ അർത്ഥമാക്കുന്നത് ആർ‌എൻ‌എയുമായി ഒരു പ്രശ്നവുമില്ല എന്നാണ്, കാരണം ആന്തരിക അവലംബം കൂടുതലായതിനാൽ, അപചയം കഠിനമല്ലാത്തിടത്തോളം കാലം ആർ‌എൻ‌എ വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും. OD₂₆₀/OD₂₈₀സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ അളക്കുന്ന ശുദ്ധമായ ആർഎൻഎയുടെ അനുപാതം 1.9 നും 2.1 നും ഇടയിലായിരിക്കണം. ആർഎൻഎയിലെ ഒരു ചെറിയ അളവിലുള്ള പ്രോട്ടീൻ അശുദ്ധി അനുപാതം കുറയ്ക്കും. മൂല്യം വളരെ താഴ്ന്നതല്ലെങ്കിൽ, ആർടി ബാധിക്കില്ല. ആർ‌ടിക്ക് ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ടത് ആർ‌എൻ‌എ സമഗ്രതയാണ്.

ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനിന്റെ വിപുലീകരണത്തിന് ആർടി വിജയിച്ചതായി മാത്രമേ സൂചിപ്പിക്കാനാകൂ, പക്ഷേ അത് സിഡിഎൻഎ സ്ട്രാൻഡിന്റെ ഗുണനിലവാരവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കണമെന്നില്ല. ആന്തരിക റഫറൻസ് ശകലങ്ങൾ പൊതുവെ ചെറിയ വലിപ്പവും ആവിഷ്കാരവും കൂടുതലായതിനാൽ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനിൽ വിജയിക്കാൻ എളുപ്പമാണ്. എന്നിരുന്നാലും, ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെ വലുപ്പവും പ്രകടനവും ജീനിൽ നിന്ന് ജീനിലേക്ക് വ്യത്യാസപ്പെടുന്നു. സിഡിഎൻഎ ഗുണനിലവാരം ആന്തരിക റഫറൻസ് ഉപയോഗിച്ച് മാത്രം വിലയിരുത്താൻ കഴിയില്ല, പ്രത്യേകിച്ച് 2 കെബിയിൽ കൂടുതൽ നീളമുള്ള ടാർഗെറ്റ് ശകലങ്ങൾക്ക്.

ചില സാമ്പിളുകൾക്ക് സങ്കീർണ്ണമായ ദ്വിതീയ ഘടനകളുണ്ട്, അല്ലെങ്കിൽ സമ്പന്നമായ ജിസി ഉള്ളടക്കമുണ്ട്, അല്ലെങ്കിൽ കുറഞ്ഞ അളവിലുള്ള വിലയേറിയതാണ്. ഈ സന്ദർഭങ്ങളിൽ, ടാർഗെറ്റ് ശകലം, സാമ്പിൾ എന്നിവയുടെ വലുപ്പം അനുസരിച്ച് അനുയോജ്യമായ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് തിരഞ്ഞെടുക്കണം. ഉയർന്ന ജിസി ഉള്ളടക്കവും സങ്കീർണ്ണമായ ദ്വിതീയ ഘടനയും ഉള്ള ആർ‌എൻ‌എ ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്ക്, കുറഞ്ഞ താപനിലയിൽ അല്ലെങ്കിൽ സാധാരണ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് ഉപയോഗിച്ച് ദ്വിതീയ ഘടന തുറക്കാൻ പ്രയാസമാണ്. ഈ ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്കായി, ക്വാണ്ട് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് തിരഞ്ഞെടുക്കാവുന്നതാണ്, കാരണം അതിന്റെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രകടനം M-MLV സീരീസ് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിനേക്കാൾ മികച്ചതാണ്, ഇത് വിവിധ ആർഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റുകളെ കാര്യക്ഷമമായി ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് ചെയ്യുകയും ആർഎൻഎയെ സിഡിഎൻഎ ആദ്യ സ്ട്രാൻഡിലേക്ക് പരമാവധി പരിവർത്തനം ചെയ്യുകയും ചെയ്യും. ജനറൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് കിറ്റ് ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, 20 μl സിസ്റ്റത്തിന് മൊത്തം RNA യുടെ 1 μg ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ മാത്രമേ ഫലപ്രദമായി തിരിച്ചെടുക്കാൻ കഴിയൂ. കിറ്റിന്റെ പരമാവധി ആർടി ശേഷി ദയവായി ശ്രദ്ധിക്കുക. ടെംപ്ലേറ്റ് അധികമായി ചേർത്തിട്ടുണ്ടെങ്കിൽ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ആർ.എൻ.എ. അതിനാൽ, സിസ്റ്റത്തിന്റെ പരമാവധി ശേഷി കവിയാതിരിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്.

ആർ‌എൻ‌എ കഠിനമായി തരംതാഴ്ത്തപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടോ എന്നും ആർ‌ടി വിജയകരമാണോ എന്നും എ -1 നിർണ്ണയിക്കുക

പൊതുവേ, ആന്തരിക റഫറൻസ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ പരാജയത്തിന്റെ കാരണം പലപ്പോഴും ഗുരുതരമായ ആർഎൻഎ അപചയം മൂലമാണ്. സാധ്യമായ മറ്റൊരു കാരണം റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പരാജയമാണ്. സി‌ഡി‌എൻ‌എ സിംഗിൾ സ്ട്രാൻഡിന്റെ ഗുണനിലവാരം വിലയിരുത്തുന്നതിന് ആന്തരിക റഫറൻസ് ഒരു മാനദണ്ഡമായി ഉപയോഗിക്കാൻ കഴിയില്ല, പക്ഷേ ആർ‌എൻ‌എ ഗുണനിലവാരത്തിൽ പ്രശ്‌നമില്ലെങ്കിൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ വിജയകരമാണോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ ഇത് ഒരു മാനദണ്ഡമായി ഉപയോഗിക്കാം. റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രക്രിയയിലെ ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ട കാര്യം പ്രതിപ്രവർത്തന കാര്യക്ഷമത മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിന് സ്ഥിരമായ താപനിലയും സ്ഥിരമായ പ്രതികരണ സംവിധാനവും നിലനിർത്തുക എന്നതാണ്.

ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനുകൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള പ്രൈമറുകൾ വിശ്വസനീയമാണോ എന്നും പിസിആറിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന റിയാക്ടറുകളിൽ എന്തെങ്കിലും പ്രശ്നങ്ങളുണ്ടോ എന്നും എ -2 നിർണ്ണയിക്കുക.

ആപേക്ഷിക ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനായി, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന് മുമ്പ് ആർഎൻഎ കണക്കാക്കണം, ഇത് പല റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കിറ്റുകളിലും ആവശ്യമാണ്, ഉദാഹരണത്തിന്, ആർഎൻഎ ഇൻപുട്ട് 1 μg ആയി കണക്കാക്കുക. റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് ചെയ്ത സിഡിഎൻഎ ആർഎൻഎ, ഒലിഗോ ഡിടി, എൻസൈം, ഡിഎൻടിപി, ഒരു ചെറിയ ഡിഎൻഎ അവശിഷ്ടം എന്നിവ ഉൾപ്പെടെയുള്ള ഒരു മിശ്രിത പരിഹാരമായതിനാൽ, വ്യതിയാനം സംഭവിക്കും, അതിനാൽ സിഡിഎൻഎ കൃത്യമായി കണക്കാക്കുന്നത് അസാധ്യമാണ്. അതിനാൽ, ആർ‌എൻ‌എ ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ ആവശ്യമാണ്. വ്യത്യസ്ത സാമ്പിളുകളിൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കാര്യക്ഷമത ഒന്നുതന്നെയാണെങ്കിലും, ലഭിച്ച സിഡിഎൻഎയുടെ അളവ് ഒന്നുതന്നെയായിരിക്കണം, കൂടാതെ അളവിലുള്ള വിശകലനം മൊത്തം ആർഎൻഎയുടെ അതേ അളവിൽ വ്യത്യസ്ത ജീനുകളുടെ എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലുകൾ താരതമ്യം ചെയ്യാൻ കഴിയും. ആപേക്ഷിക ഫ്ലൂറസൻസ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ നടത്തുമ്പോൾ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന് ശേഷം ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് സിഡിഎൻഎ ആവശ്യമായി വരില്ല, കാരണം ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീൻ റഫറൻസായി പ്രവർത്തിക്കാൻ കഴിയും.

ഇത് പ്രധാനമായും ജീനുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ നീണ്ട ശകലത്തിന്റെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ മിക്ക ജീനുകൾക്കും പ്രായോഗികമല്ല. ഒന്നാമതായി, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന്റെ കാര്യക്ഷമത പിസിആറിനേക്കാൾ വളരെ കുറവാണ്. രണ്ടാമതായി, ജിസി സമ്പന്നമായ മേഖലയും നിരവധി ജീനുകളുടെ ദ്വിതീയ ഘടനയും റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനും പിസിആറും നിയന്ത്രിക്കുന്നു. അവസാനമായി, പിസിആറിന്റെ വിശ്വസ്തതയും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയും ഒരേ സമയം ഉറപ്പ് നൽകാൻ പ്രയാസമാണ്. റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രക്രിയയിൽ, കുറഞ്ഞ കോപ്പി ജീനുകൾക്കായി പ്രത്യേകിച്ച് ശകലങ്ങൾ ലഭിക്കുമെന്ന് ആർക്കും ഉറപ്പ് നൽകാൻ കഴിയില്ല, പ്രത്യേകിച്ച് ഒളിഗോ ഡിടി ഉപയോഗിച്ച്. കൂടുതൽ GC ഉള്ള 5 'UTR- നെ സംബന്ധിച്ചിടത്തോളം, ഇത് കൂടുതൽ ബുദ്ധിമുട്ടാണ്. അതിനാൽ, ക്രമരഹിതമായ പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് റിവേഴ്സ് ചെയ്യുക, ടാർഗെറ്റ് ശകലത്തിലെ സ്വാഭാവിക വിള്ളൽ സൈറ്റുകൾ കണ്ടെത്തുക, സെഗ്മെന്റുകൾ ഉപയോഗിച്ച് വർദ്ധിപ്പിക്കുക, തുടർന്ന് നിയന്ത്രണ ദഹനവും ലിഗേഷനും നടത്തുന്നത് ന്യായമായ രീതിയാണ്. പൊതുവേ, 2 kb- ൽ കൂടുതലുള്ള ശകലങ്ങൾ നേരിട്ട് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നത് ബുദ്ധിമുട്ടാണ്, പക്ഷേ അത് എല്ലായ്പ്പോഴും ലഭിക്കുന്നത് അസാധ്യമല്ല: 1. ഒന്നാമതായി, RNA/mRNA- യുടെ സമഗ്രത ഉറപ്പ് നൽകുന്നു, കൂടാതെ ട്രൈസോൾ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതാണ് അഭികാമ്യം. 2.M-MLV RT-PCR കിറ്റ് നേരിട്ട് ഉപയോഗിക്കാം. അനിയലിംഗ് സമയം വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രക്രിയയിൽ സൈക്കിൾ നമ്പർ ശരിയായി വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുക. പകരമായി, സാധാരണ പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന് മുമ്പായി ഉചിതമായ വിപുലീകൃത ഡീനാറ്ററേഷനും വിപുലീകരണ സമയവും ഉപയോഗിച്ച് ഒന്നോ രണ്ടോ പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങൾ നടത്തുക, അല്ലെങ്കിൽ ശകലങ്ങൾ നീട്ടാൻ സഹായിച്ചേക്കാം. പോളിമറേസിന്റെ വിശ്വാസ്യത ശ്രദ്ധിക്കുക. 3. അനുയോജ്യമായ ഫലങ്ങൾ ലഭിക്കുന്നതിന് പിസിആറിൽ ലോംഗ് ടാക് ഉപയോഗിക്കാം. 4. പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷൻ പ്രയോഗത്തിന്, ഉയർന്ന വിശ്വാസ്യതയുള്ള പോളിമറേസ് പ്രയോഗിക്കണം.

TIANGEN വാഗ്ദാനം ചെയ്യുന്ന രണ്ട് തരം റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്‌റ്റേസ് ഉണ്ട്: ക്വാണ്ട്/കിംഗ് RTase, TIANScript M-MLV. അവ തമ്മിലുള്ള പ്രധാന വ്യത്യാസം ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെ ഇൻപുട്ട് അളവാണ്. ക്വാളിറ്റ് ഒരു അതുല്യമായ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്‌റ്റേസ് ആണ്, ഇത് മോളോണി മുരിൻ ലുക്കീമിയ വൈറസിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന M-MLV- ൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമാണ്. എഞ്ചിനീയറിംഗ് എസ്ചെറിച്ചിയ കോളി വീണ്ടും സംയോജിപ്പിച്ച് പ്രകടിപ്പിച്ച ഒരു പുതിയ ഉയർന്ന കാര്യക്ഷമതയുള്ള റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസാണ് ക്വാന്റ്. ഉയർന്ന റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ പ്രവർത്തനവും ഉയർന്ന വിളവും ഉള്ള 50 ng-2 μg ആർഎൻഎ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് ക്വാണ്ട് അനുയോജ്യമാണ്. സാധാരണ MMLV അല്ലെങ്കിൽ AMV യുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, ക്വാണ്ടിന്റെ ഏറ്റവും വലിയ പ്രത്യേകത ആർ.എൻ.എ ടെംപ്ലേറ്റുകളുമായി വളരെ ശക്തമായ അടുപ്പം ഉണ്ട്, ഉയർന്ന താപനില ഡീനാറ്ററേഷൻ ഇല്ലാതെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് കോംപ്ലക്സ് ടെംപ്ലേറ്റുകൾ മാറ്റാൻ കഴിയും എന്നതാണ്. ഉയർന്ന ജിസി ഉള്ളടക്കമുള്ള ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്ക്, റിവേഴ്സ് കാര്യക്ഷമത കൂടുതലാണ്. എന്നിരുന്നാലും, ഈ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിന് RNase H പ്രവർത്തനം ഉണ്ട്, ഇത് cDNA ഉൽപന്നത്തിന്റെ ദൈർഘ്യത്തെ ബാധിച്ചേക്കാം (<4.5 kb ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്ക് അനുയോജ്യം). പരമ്പരാഗത റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന്, TIANScript MMLV റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു. ഈ RTase വളരെ ദുർബലമായ RNase H പ്രവർത്തനമുള്ള ഒരു പരിഷ്കരിച്ച എൻസൈമാണ്, ഇത് നീണ്ട (> 5 kb) cDNA സിന്തസിസിന് അനുയോജ്യമാണ്.

സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസിനും ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും ഇടയിലുള്ള ട്യൂബ് കവർ തുറക്കാതെ ഒരേ ട്യൂബിൽ ഒറ്റ-ഘട്ട റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനും പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും പൂർത്തിയാക്കുന്നു, ഇത് മലിനീകരണം കുറയ്ക്കാൻ സഹായകമാണ്. ലഭിച്ച എല്ലാ സിഡിഎൻഎ സാമ്പിളുകളും ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി ഉപയോഗിക്കുന്നതിനാൽ, സംവേദനക്ഷമത കൂടുതലാണ്, മൊത്തം ആർ‌എൻ‌എയുടെ കുറഞ്ഞത് 0.01 പിജി. വിജയകരമായ ഒറ്റ-ഘട്ട ആർടിപിസിആറിനായി, സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസ് ആരംഭിക്കാൻ ജീൻ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്നു. രണ്ട്-ഘട്ട രീതി, അതായത് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ, പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ എന്നിവ രണ്ട് ഘട്ടങ്ങളിലാണ് നടത്തുന്നത്. ആദ്യം റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഒരു ആർഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റിൽ നിന്ന് സിഡിഎൻഎ ലഭിക്കുന്നു, ലഭിച്ച സിഡിഎൻഎ ഒന്നോ അതിലധികമോ വ്യത്യസ്ത പിസിആർ പ്രതികരണങ്ങൾക്ക് വിധേയമാകുന്നു. സിഡിഎൻഎയുടെ ആദ്യ സ്ട്രാൻഡിന്റെ സമന്വയത്തെ നയിക്കാൻ രണ്ട്-ഘട്ട രീതിക്ക് ഒലിഗോ (ഡിടി) അല്ലെങ്കിൽ റാൻഡം പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കാം, കൂടാതെ ഒരു പ്രത്യേക സാമ്പിളിൽ നിന്ന് എല്ലാ എംആർഎൻഎ വിവരങ്ങളും വിപരീതമാക്കാം.