TIANSeq ഫാസ്റ്റ് RNA ലൈബ്രറി കിറ്റ് (ഇല്ലുമിന)

നിലവിൽ, ഹൈ-ത്രൂപുട്ട് സീക്വൻസിംഗ് സാങ്കേതികവിദ്യ പ്രധാനമായും അടുത്ത തലമുറ സീക്വൻസിംഗ് സാങ്കേതികവിദ്യയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്. അടുത്ത തലമുറ സീക്വൻസിംഗ് സാങ്കേതികവിദ്യയുടെ വായനാ ദൈർഘ്യം പരിമിതമായതിനാൽ, നമ്മൾ മുഴുവൻ ദൈർഘ്യമുള്ള ശ്രേണികളെ ചെറിയ ശകല ലൈബ്രറികളായി വിഭജിക്കണം. വ്യത്യസ്ത സീക്വൻസിംഗ് പരീക്ഷണങ്ങളുടെ ആവശ്യങ്ങൾക്കനുസരിച്ച്, ഞങ്ങൾ സാധാരണയായി സിംഗിൾ-എൻഡ് സീക്വൻസിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ ഡബിൾ-എൻഡ് സീക്വൻസിംഗ് തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നു. നിലവിൽ അടുത്ത തലമുറ സീക്വൻസിംഗ് ലൈബ്രറിയുടെ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ സാധാരണയായി 200-800 ബിപി പരിധിയിലാണ് വിതരണം ചെയ്യുന്നത്.

എ) ഡിഎൻഎ ഗുണനിലവാരമില്ലാത്തതും ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. എൻസൈം പ്രവർത്തനം തടയുന്നതിന് ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള ഡിഎൻഎ സാമ്പിളുകൾ ഉപയോഗിക്കുക.

ബി) ഡിഎൻഎ ലൈബ്രറി നിർമ്മിക്കാൻ പിസിആർ രഹിത രീതി ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ ഡിഎൻഎ സാമ്പിളിന്റെ അളവ് അപര്യാപ്തമാണ്. വിഘടിച്ച ഡിഎൻഎയുടെ ഇൻപുട്ട് 50 എൻജി കവിയുമ്പോൾ, ലൈബ്രറി നിർമ്മാണ പ്രക്രിയയിൽ പിസിആർ രഹിത വർക്ക്ഫ്ലോ തിരഞ്ഞെടുക്കാവുന്നതാണ്. ലൈബ്രറിയുടെ പകർപ്പ് നമ്പർ നേരിട്ട് ക്രമീകരിക്കാൻ കഴിയാത്തവിധം കുറവാണെങ്കിൽ, അഡാപ്റ്റർ ലിഗേഷനുശേഷം ഡിഎൻഎ ലൈബ്രറി പിസിആർ വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.

സി) ആർ‌എൻ‌എ മലിനീകരണം കൃത്യമല്ലാത്ത പ്രാരംഭ ഡി‌എൻ‌എ ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനിലേക്ക് നയിക്കുന്നു, ആർ‌എൻ‌എ മലിനീകരണം ജനിതക ഡി‌എൻ‌എയുടെ ശുദ്ധീകരണ പ്രക്രിയയിൽ നിലനിൽക്കാം, ഇത് ലൈബ്രറി നിർമ്മാണ സമയത്ത് കൃത്യമല്ലാത്ത ഡി‌എൻ‌എ ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനും അപര്യാപ്തമായ ഡി‌എൻ‌എ ലോഡിംഗിനും ഇടയാക്കും. ആർ‌എൻ‌എസുമായി ചികിത്സിക്കുന്നതിലൂടെ ആർ‌എൻ‌എ നീക്കംചെയ്യാനാകും.

എ -1

a) ചെറിയ ശകലങ്ങൾ (60 bp-120 bp) പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നു ചെറിയ ശകലങ്ങൾ സാധാരണയായി അഡാപ്റ്റർ ശകലങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ അഡാപ്റ്ററുകൾ രൂപംകൊണ്ട ഡൈമറുകൾ ആണ്. Agencourt AMPure XP മാഗ്നറ്റിക് മുത്തുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ശുദ്ധീകരിക്കുന്നതിലൂടെ ഈ അഡാപ്റ്റർ ശകലങ്ങൾ ഫലപ്രദമായി നീക്കം ചെയ്യാനും സീക്വൻസിംഗ് ഗുണനിലവാരം ഉറപ്പാക്കാനും കഴിയും.

ബി) പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനുശേഷം ലൈബ്രറിയിൽ വലിയ ശകലങ്ങൾ പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നു, അഡാപ്റ്റർ ലിഗേറ്റ് ചെയ്ത ശേഷം ലൈബ്രറി ഡിഎൻഎ ശകലത്തിന്റെ വലുപ്പം 120 ബിപി വർദ്ധിക്കും. അഡാപ്റ്റർ ലിഗേഷനുശേഷം ഡിഎൻഎ ശകലം 120 ബിപിയിൽ കൂടുതലാണെങ്കിൽ, അമിതമായ പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ അസാധാരണമായ ശകലങ്ങളുടെ വർദ്ധനവ് കാരണമാകാം. പിസിആർ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം കുറയ്ക്കുന്നത് സാഹചര്യം തടയാൻ കഴിയും.

സി) അഡാപ്റ്റർ ലിഗേഷനുശേഷം ലൈബ്രറി ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ അസാധാരണ വലുപ്പം ഈ കിറ്റിലെ അഡാപ്റ്ററിന്റെ നീളം 60 ബിപി ആണ്. ശകലത്തിന്റെ രണ്ട് അറ്റങ്ങളും അഡാപ്റ്ററുകളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുമ്പോൾ, ദൈർഘ്യം 120 bp വർദ്ധിക്കും. ഈ കിറ്റ് നൽകിയതല്ലാതെ ഒരു അഡാപ്റ്റർ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, അഡാപ്റ്റർ ദൈർഘ്യം പോലുള്ള പ്രസക്തമായ വിവരങ്ങൾ നൽകാൻ വിതരണക്കാരനെ ബന്ധപ്പെടുക. പരീക്ഷണ വർക്ക്ഫ്ലോയും പ്രവർത്തനവും മാനുവലിൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന ഘട്ടങ്ങൾ പാലിക്കുന്നുണ്ടെന്ന് ഉറപ്പുവരുത്തുക.

ഡി) അഡാപ്റ്റർ ലിഗേഷന് മുമ്പുള്ള അസാധാരണ ഡിഎൻഎ ശകലം വലിപ്പം ഈ പ്രശ്നത്തിന്റെ കാരണം ഡിഎൻഎ ഫ്രാഗ്മെന്റേഷൻ സമയത്ത് തെറ്റായ പ്രതികരണ സാഹചര്യങ്ങൾ കാരണമാകാം. വ്യത്യസ്ത ഡിഎൻഎ ഇൻപുട്ടിനായി വ്യത്യസ്ത പ്രതികരണ സമയങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കണം. ഡി‌എൻ‌എ ഇൻപുട്ട് 10 എൻ‌ജിയിൽ കൂടുതലാണെങ്കിൽ, ഒപ്റ്റിമൈസേഷന്റെ ആരംഭ സമയമായി 12 മിനിറ്റിന്റെ പ്രതികരണ സമയം തിരഞ്ഞെടുക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു, ഈ സമയത്ത് നിർമ്മിക്കുന്ന ശകലത്തിന്റെ വലുപ്പം പ്രധാനമായും 300-500 ബിപി പരിധിയിലാണ്. ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ആവശ്യമായ വലുപ്പത്തിൽ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുന്നതിന് ഉപയോക്താക്കൾക്ക് അവരുടെ സ്വന്തം ആവശ്യങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് 2-4 മിനിറ്റ് വരെ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ നീളം കൂട്ടാനോ കുറയ്ക്കാനോ കഴിയും.

എ -2

എ) വിഘടിക്കുന്ന സമയം ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്തിട്ടില്ലെങ്കിൽ, വിഘടിച്ച ഡിഎൻഎ വളരെ ചെറുതോ വലുതോ ആണെങ്കിൽ, പ്രതികരണ സമയം നിർണ്ണയിക്കാൻ നിർദ്ദേശത്തിൽ നൽകിയിരിക്കുന്ന വിഘടനാ സമയ തിരഞ്ഞെടുപ്പിനുള്ള മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങൾ കാണുക, കൂടാതെ ഈ സമയ പോയിന്റ് ഒരു നിയന്ത്രണമായി ഉപയോഗിക്കുക, കൂടാതെ ഒരു സജ്ജമാക്കുക വിഘടനാസമയത്ത് കൂടുതൽ കൃത്യമായ ക്രമീകരണം വരുത്തുന്നതിന് 3 മിനിറ്റ് നീട്ടാനോ കുറയ്ക്കാനോ ഉള്ള പ്രതികരണ സംവിധാനം.

എ -3

വിഘടിത ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം ഡിഎൻഎയുടെ അസാധാരണ വലുപ്പ വിതരണം

എ) ഫ്രാഗ്മെന്റേഷൻ റിയാജന്റിന്റെ തെറ്റായ ഉരുകൽ രീതി, അല്ലെങ്കിൽ ഉരുകിയതിനുശേഷം റിയാജന്റ് പൂർണ്ണമായും മിശ്രിതമല്ല. 5 × ഫ്രാഗ്മെന്റേഷൻ എൻസൈം മിക്സ് റിയാജന്റ് ഐസിൽ ഉരുകുക. ഉരുകിയുകഴിഞ്ഞാൽ, ട്യൂബിന്റെ അടിഭാഗം സentlyമ്യമായി അമർത്തിക്കൊണ്ട് റിയാജന്റ് തുല്യമായി ഇളക്കുക. റിയാക്ടറിനെ ചുഴറ്റരുത്!

ബി) ഡിഎൻഎ ഇൻപുട്ട് സാമ്പിളിൽ EDTA അല്ലെങ്കിൽ മറ്റ് മലിനീകരണം അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു ഉപ്പ് അയോണുകളുടെ കുറവ്, DNA ശുദ്ധീകരണ ഘട്ടത്തിലെ ചെലേറ്റിംഗ് ഏജന്റുകൾ പരീക്ഷണത്തിന്റെ വിജയത്തിന് പ്രത്യേകിച്ചും പ്രധാനമാണ്. ഡിഎൻഎ 1 × ടിഇയിൽ അലിഞ്ഞുചേർന്നാൽ, വിഘടനം നടത്താൻ നിർദ്ദേശത്തിൽ നൽകിയിരിക്കുന്ന രീതി ഉപയോഗിക്കുക. ലായനിയിലെ EDTA സാന്ദ്രത അനിശ്ചിതമാണെങ്കിൽ, ഡിഎൻഎ ശുദ്ധീകരിക്കാനും തുടർന്നുള്ള പ്രതികരണത്തിനായി ഡയോണൈസ്ഡ് വെള്ളത്തിൽ ലയിപ്പിക്കാനും ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

സി) കൃത്യമല്ലാത്ത പ്രാരംഭ ഡിഎൻഎ അളവ് വിഘടിത ചികിത്സയ്ക്ക് മുമ്പ്, പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിലെ ഡിഎൻഎയുടെ കൃത്യമായ അളവ് നിർണ്ണയിക്കാൻ ക്യുബിറ്റ്, പികോഗ്രീൻ, മറ്റ് രീതികൾ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഡിഎൻഎയുടെ കൃത്യമായ അളവ് നിർണ്ണയിക്കേണ്ടത് അത്യാവശ്യമാണ്.

 d) പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിന്റെ തയ്യാറെടുപ്പ് നിർദ്ദേശങ്ങൾ പാലിക്കുന്നില്ല, ശിഥിലമായ പ്രതിപ്രവർത്തന സംവിധാനം തയ്യാറാക്കുന്നത് നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായി ഹിമത്തിൽ നടത്തണം. മികച്ച പ്രഭാവം ഉറപ്പാക്കാൻ, എല്ലാ പ്രതികരണ ഘടകങ്ങളും ഹിമത്തിൽ സ്ഥാപിക്കുകയും പൂർണ്ണ തണുപ്പിക്കൽ കഴിഞ്ഞ് പ്രതികരണ സംവിധാനം തയ്യാറാക്കുകയും വേണം. തയ്യാറെടുപ്പ് പൂർത്തിയായ ശേഷം, നന്നായി ഇളക്കുകയോ ഫ്ലിക്ക് ചെയ്യുകയോ ചെയ്യുക. ചുഴലിക്കാറ്റ് ചെയ്യരുത്!

1. അനുചിതമായ മിശ്രിത രീതി (ചുഴലിക്കാറ്റ്, അക്രമാസക്തമായ ആന്ദോളനം മുതലായവ) ലൈബ്രറി ശകലങ്ങളുടെ അസാധാരണ വിതരണത്തിന് കാരണമാകും (ഇനിപ്പറയുന്ന ചിത്രത്തിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ), അങ്ങനെ ലൈബ്രറിയുടെ ഗുണനിലവാരത്തെ ബാധിക്കുന്നു. അതിനാൽ, ഫ്രാഗ്മെന്റേഷൻ മിക്സ് റിയാക്ഷൻ സൊല്യൂഷൻ തയ്യാറാക്കുമ്പോൾ, സ mixമ്യമായി മുകളിലേക്കും താഴേക്കും കുഴയ്ക്കുക, അല്ലെങ്കിൽ വിരൽത്തുമ്പിൽ ഫ്ലിക്ക് ചെയ്ത് തുല്യമായി ഇളക്കുക. ചുഴിയിൽ കലരാതിരിക്കാൻ ശ്രദ്ധിക്കുക.

2. ലൈബ്രറി നിർമ്മാണത്തിന് ഉയർന്ന പരിശുദ്ധി ഡിഎൻഎ ഉപയോഗിക്കണം

DNA നല്ല ഡിഎൻഎ സമഗ്രത: ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ബാൻഡ് 30 കെബിയിൽ കൂടുതലാണ്, വാലില്ലാതെ

OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. ഡിഎൻഎ ഇൻപുട്ട് തുക കൃത്യമായിരിക്കണം, നാനോഡ്രോപ്പിനേക്കാൾ ഡിഎൻഎ അളക്കാൻ ക്യുബിറ്റ്, പിക്കോഗ്രീൻ രീതികൾ ഉപയോഗിക്കാൻ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു.

4. ഡിഎൻഎ ലായനിയിലെ ഇഡിടിഎയുടെ ഉള്ളടക്കം നിർണയിക്കണം, ഇഡിടിഎയ്ക്ക് വിഘടനാ പ്രതികരണത്തിൽ വലിയ സ്വാധീനമുണ്ട്. EDTA- യുടെ ഉള്ളടക്കം ഉയർന്നതാണെങ്കിൽ, തുടർന്നുള്ള പരിശോധനയ്ക്ക് മുമ്പ് DNA ശുദ്ധീകരണം നടത്തേണ്ടതുണ്ട്.

5. ഫ്രാഗ്മെന്റേഷൻ റിയാക്ഷൻ സൊല്യൂഷൻ ഐസിൽ തയ്യാറാക്കണം പ്രതികരണ സമയത്തിന്റെ കൃത്യത ഉറപ്പുവരുത്തുന്നതിനായി, ദയവായി ഐസിൽ പ്രതികരണ സംവിധാനം തയ്യാറാക്കുക.

6. ഫ്രാഗ്മെന്റേഷൻ പ്രതികരണ സമയം കൃത്യമായിരിക്കണം.

1. ഈ കിറ്റിന് ഏതുതരം സാമ്പിൾ ബാധകമാണ്?

ഈ കിറ്റിന്റെ ബാധകമായ സാമ്പിൾ തരം മൊത്തം ആർ‌എൻ‌എ അല്ലെങ്കിൽ നല്ല ആർ‌എൻ‌എ സമഗ്രതയുള്ള ശുദ്ധീകരിച്ച mRNA ആകാം. ലൈബ്രറി നിർമ്മിക്കാൻ മൊത്തം ആർ‌എൻ‌എ ഉപയോഗിക്കുന്നുവെങ്കിൽ, ആദ്യം ആർ‌ആർ‌എൻ‌എ നീക്കംചെയ്യുന്നതിന് ആർ‌ആർ‌എൻ‌എ ഡിപ്ലീഷൻ കിറ്റ് (ക്യാറ്റ്#4992363/4992364/4992391) ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

2. ഈ കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് ലൈബ്രറി നിർമ്മിക്കാൻ FFPE സാമ്പിളുകൾ ഉപയോഗിക്കാമോ?

FFPE സാമ്പിളുകളിലെ mRNA ഒരു പരിധിവരെ തരംതാഴ്ത്തപ്പെടും, താരതമ്യേന മോശം സത്യസന്ധതയോടെ. ലൈബ്രറി നിർമ്മാണത്തിനായി ഈ കിറ്റ് ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, ഫ്രാഗ്മെന്റേഷൻ സമയം ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (ഫ്രാഗ്മെൻറേഷൻ സമയം കുറയ്ക്കുകയോ അല്ലെങ്കിൽ വിഘടനം നടത്താതിരിക്കുകയോ ചെയ്യുക).

3. ഉൽപ്പന്ന മാനുവലിൽ നൽകിയിരിക്കുന്ന വലുപ്പം തിരഞ്ഞെടുക്കൽ ഘട്ടം ഉപയോഗിച്ച്, ഉൾപ്പെടുത്തിയ സെഗ്‌മെന്റിൽ ചെറിയ വ്യതിയാനം പ്രത്യക്ഷപ്പെടാൻ ഇടയാക്കിയതെന്താണ്?

ഈ ഉൽപ്പന്ന മാനുവലിലെ വലുപ്പം തിരഞ്ഞെടുക്കുന്ന ഘട്ടത്തിന് അനുസൃതമായി വലുപ്പ തിരഞ്ഞെടുക്കൽ നടത്തണം. വ്യതിയാനം ഉണ്ടെങ്കിൽ, കാരണം കാന്തിക മുത്തുകൾ temperatureഷ്മാവിൽ സന്തുലിതമല്ല അല്ലെങ്കിൽ പൂർണ്ണമായി മിശ്രിതമല്ല, പൈപ്പറ്റ് കൃത്യമല്ല അല്ലെങ്കിൽ ദ്രാവകം നുറുങ്ങിൽ തുടരും. പരീക്ഷണത്തിനായി കുറഞ്ഞ ആഡ്സോർപ്ഷൻ ഉള്ള നുറുങ്ങുകൾ ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

4. ലൈബ്രറി നിർമ്മാണത്തിൽ അഡാപ്റ്ററുകളുടെ തിരഞ്ഞെടുപ്പ്

ലൈബ്രറി നിർമ്മാണ കിറ്റിൽ അഡാപ്റ്റർ റിയാജന്റ് അടങ്ങിയിട്ടില്ല, കൂടാതെ ഈ കിറ്റ് TIANSeq സിംഗിൾ-ഇൻഡക്സ് അഡാപ്റ്റർ (Illumina) (4992641/4992642/4992378) ഉപയോഗിച്ച് ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

5. ലൈബ്രറിയുടെ ക്യുസി

ലൈബ്രറി ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് ഡിറ്റക്ഷൻ: ലൈബ്രറിയുടെ പിണ്ഡ സാന്ദ്രതയും മോളാർ സാന്ദ്രതയും നിർണ്ണയിക്കാൻ ക്യുബിറ്റും ക്യുപിസിആറും ഉപയോഗിക്കുന്നു. ഉൽപ്പന്ന മാനുവലിന് അനുസൃതമായാണ് പ്രവർത്തനം. ലൈബ്രറിയുടെ സാന്ദ്രത സാധാരണയായി NGS സീക്വൻസിംഗിന്റെ ആവശ്യകതകൾ നിറവേറ്റും. ലൈബ്രറി വിതരണ ശ്രേണി കണ്ടെത്തൽ: ലൈബ്രറി വിതരണ ശ്രേണി കണ്ടെത്താൻ അജിലന്റ് 2100 ബയോഅനലൈസർ ഉപയോഗിക്കുന്നു.

6. ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സൈക്കിൾ നമ്പർ തിരഞ്ഞെടുക്കൽ

നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച്, PCR സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം 6-12 ആണ്, സാമ്പിൾ ഇൻപുട്ട് അനുസരിച്ച് ആവശ്യമായ PCR സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം തിരഞ്ഞെടുക്കണം. ഉയർന്ന വിളവ് ലഭിക്കുന്ന ലൈബ്രറികളിൽ, സാധാരണഗതിയിൽ വ്യത്യസ്ത അളവിലാണ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സംഭവിക്കുന്നത്, ഇത് അജിലന്റ് 2100 ബയോഅനലൈസർ കണ്ടെത്തുന്നതിലെ ടാർഗെറ്റ് ശ്രേണിയുടെ ഉന്നതിക്ക് ശേഷം അൽപ്പം വലിയ കൊടുമുടിയിലൂടെ പ്രകടമാകുന്നു, അല്ലെങ്കിൽ ക്യുബിറ്റിന്റെ സാന്ദ്രത ക്യുപിസിആറിനേക്കാൾ കുറവാണ്. മൈൽഡ് ഓവർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഒരു സാധാരണ പ്രതിഭാസമാണ്, ഇത് ലൈബ്രറി സീക്വൻസിംഗിനെയും തുടർന്നുള്ള ഡാറ്റ വിശകലനത്തെയും ബാധിക്കില്ല.

7. അജിലന്റ് 2100 ബയോഅനലൈസറിന്റെ കണ്ടെത്തൽ പ്രൊഫൈലിൽ സ്പൈക്കുകൾ പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നു

അജിലന്റ് 2100 ബയോഅനലൈസർ കണ്ടെത്തലിൽ സ്പൈക്കുകൾ പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നത് സാമ്പിളുകളുടെ അസമമായ വിഘടനം മൂലമാണ്, അവിടെ നിശ്ചിത വലുപ്പത്തിൽ കൂടുതൽ ശകലങ്ങൾ ഉണ്ടാകും, ഇത് പിസിആർ സമ്പുഷ്ടീകരണത്തിന് ശേഷം കൂടുതൽ വ്യക്തമാകും. ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, വലിപ്പം തിരഞ്ഞെടുക്കരുതെന്ന് നിർദ്ദേശിക്കപ്പെടുന്നു, അതായത് ശകലത്തിന്റെ അവസ്ഥ 94 ° C ആയി 15 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റഡ് ആയി സജ്ജമാക്കുക, അവിടെ ശകലത്തിന്റെ വിതരണം ചെറുതും കേന്ദ്രീകൃതവുമാണ്, കൂടാതെ ഏകത മെച്ചപ്പെടുത്താനും കഴിയും.